Уравнение михаэлиса ментен и его линеаризация

Зависимость фермента от количества субстрата описывает ферментативная кинетика

Уравнения Михаэлиса-Ментен и Лайнуивера-Берка

Общую теорию ферментативной кинетики и зависимость активности фермента от субстрата.описали Л.Михаэлис и М.Л.Ментен, выразив его в своем уравнении. Бриггс и Холдейн усовершенствовали их уравнение, введя введя в него константу Михаэлиса (Km), определяемую экспериментально.

Уравнение Михаэлиса-Ментен показывает взаимосвязь максимально возможной скорости, реальной скорости реакции, константы Михаэлиса и концентрации субстрата. Так как пользоваться графиком, построенным в прямых координатах V и [S] для точных расчетов неудобно, то Г.Лайнуивер и Д.Бэрк преобразовали уравнение Бриггса–Холдейна в обратные координаты.

Уравнение Михаэлиса-Ментен

Уравнение Лайнуивера-Бэрка

На самом деле уравнение Михаэлиса-Ментен в данном виде предложили Бриггс и Холдейн, но в честь основоположников оно носит название Михаэлиса-Ментен.

Выделяют три основных решения уравнения Михаэлиса-Ментен:

1. Концентрация субстрата равна величине константы Михаэлиса ([S] = Km).
В этом случае, решая уравнение Михаэлиса-Ментен, получаем, что скорость реакции V будет равна половине максимальной Vmax.(V = ½ Vmax).

В математическом смысле Km соответствует концентрации субстрата при которой скорость реакции равна половине максимальной. Ее биологический смысл заключается в характеристике сродства фермента к субстрату, а именно: увеличение величины Кm означает снижение сродства фермента к субстрату.

2. Концентрация субстрата значительно больше Km ([S] >> Km). В этом случае величиной Km можно пренебречь, при решении получим, что скорость реакции максимальна (плато на графике).

3. Концентрация субстрата значительно меньше Km ([S]

Методы определения Км и Vmax

Константу Михаэлиса можно определить из графика Михаэлиса (рис.2.2.1), найдя графическим способом максимальную скорость и соответствующую величину концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции будет вдвое меньше Vmax. Эта величина [S] и будет Км. Таким способом можно определить только приблизительную величину константы Михаэлиса из-за трудности точного графического определения Vmax.

Более удобными являются методы, в которых осуществлена линеаризация уравнения Михаэлиса-Ментен, т. е. гиперболическая зависимость v от [S] переведена в линейную.

Для того чтобы построить такой график, необходимо определить в одинаковых условиях при различных концентрациях субстрата и [E]= const начальные скорости ферментативной реакции.

Метод Лайнуивера-Берка. Один из способов линеаризации уравнения Михаэлиса-Ментен предложили Лайнуивер и Берк (Lineweaver H., Burk D.). Это так называемый метод двойных обратных величин. Для линеаризации необходимо взять обратные величины от левой и правой частей уравнения (3), в результате чего оно преобразуется в уравнение вида,

согласно которому между величинами, обратными начальной скорости (1/v, v -1 ) и концентрации субстрата (1/[S], [S] -1 ) соблюдается линейная зависимость, если механизм реакции подчиняется изложенным выше представлениям (рис.2.2.3).

Рис. 2.2.3. График зависимости 1/v от 1/[S] (график Лайнуивера-Берка)

Экспериментальная прямая пересекает ось абсцисс в точке (-1/[S] = 1/Км), а ось ординат – в точке (1/v = 1/Vмах). Тангенс угла наклона равен Км/Vмах. Этим широко пользуются для определения параметров Км и Vмах, характеризующих связывающую и каталитическую функции ферментов.

Метод Хайнса-Вульфа. В этом случае преобразуется уравнение Лайнуивера-Берка путем умножения правой и левой частей на концентрацию субстрата.

Графическая зависимость приведена на рис.2.2.4.

Рис. 2.2.4. График зависимости [S]/v от [S] (график Хайнса-Вульфа)

Это прямая с наклоном 1/Vmax, отсекающая на осях [S]/v и [S] отрезки Км/ Vmax и – Км соответственно.

Метод Иди-Хофсти. При одном из таких графических преобразований в так называемом графике Иди-Хофсти(pиc.2.2.5) строят график зависимости v от v/[S]. В этом случае точка пересечения прямой, полученной путем наилучшей линейной аппроксимации экспериментальных точек, с осью ординат соответствует Vmax, а тангенс угла наклона равен – K_m. Данный способ линеаризации приведен на рис. 2.2.5.

Рис. 2.2.5. График зависимости v от v/[S] (график Эди-Хофсти)

Метод Эйзенталя и Корниш-Боудена. Много позднее Эйзенталь и Корниш-Боуден предложили иной метод графического представления результатов исследования кинетики ферментативных реакций – так называемый прямой линейный график. Уравнение Михаэлиса-Ментен они преобразовали в виде зависимости Vmax от Км:

Для любой пары значений [S] и v можно построить зависимость Vmax от Км. Она представляет прямую с наклоном, равным v/[S], и отрезками, отсекаемыми на осях Км и Vmax, соответственно равными -[S] v. Если провести прямые для нескольких пар значений [S] и v, то эти прямые пересекутся в одной точке, координаты которой дадут единственные значения Vmax от Км, удовлетворяющие всем парам значений [S] и v (рис.2.2.6).

Преимущества такого графика очевидно: для его построения не требуется никаких расчетов, он позволяет очень просто выявить ошибочные данные (иакие прямые будут выпадать из основной совокупности прямых).

Уравнение Михаэлиса лежит в основе всех кинетических исследований ферментативных реакций, так как оно позволяет рассчитать количественные характеристики ферментов и проводить анализ их ингибирования. Величины К_m и V_max являются важнейшими характеристиками ферментов и их можно определить, используя линеаризованные формы уравнения Михаэлиса-Ментен.

В заключении необходимо отметить, что графические методы для определения V и К_m не являются оптимальными. В настоящее время данные ферментативной кинетики обрабатывают быстрее и более объективно с помощью компьютерных программ.

Процессы, приводящие к денатурации фермента, могут иметь различную физико-химическую природу. Конформация белковой молекулы в растворе зависит от двух показателей – величины рН и температуры. Повышение температуры приводит к нарушению системы слабых связей, стабилизирующих белковую молекулу. Длительное воздействие повышенной температуры приводит к необратимым изменениям структуры фермента, сопровождающимся потерей активности (тепловая денатурация).

Каждый фермент характеризуется соответствующим зарядом, создаваемым ионогенными группами аминокислотных остатков. При очень низких или высоких значениях рН изменение степени ионизации функциональных групп может приводить к необратимым нарушениям нативной конформации молекулы фермента с разрушением структуры активного центра.

Конформационные изменения в белковой молекулу сопровождаются изменениями спектров поглощения и флуоресценции ароматических аминокислот – тирозина и триптофана в ультрафиолетовой области спектра (

290 нм), что позволяет отслеживать изменения в структуре фермента. Обратимые конформационные, вызванные изменением температуры или концентрацией протонов водорода, осуществляются в течение 10 -4 – 10 -1 с, необратимые денатурационные изменения в зависимости от условий – в течение 1-10 3 мин. Более подробный анализ кинетики денатурации ферментов рассмотрен в Теме 5 учебного пособия по самостоятельной работе.

Лекция_методы определения константы михаэлиса и максимальной скорости процесса

Существует несколько методов определения параметров уравнения Михаэлиса-Ментен (константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции) для односубстратной реакции. Наиболее распространенный из них – линеаризация уравнения Михаэлиса-Ментен. Полный анализ включает определение не только V_max и K_M, но и K_S, k₁, k_-1, k₂.

Из кривой, построенной на основе исходного уравнения Михаэлиса-Ментен, можно определить графическим методом значения констант V_max и K_M, но это неудобно, так как невозможно провести асимптоту к гиперболе с хорошей точностью.

Первый способ линеаризации был описан Холдейном и Штерном в их учебнике по энзимологии. Для осуществления такого преобразования уравнение Михаэлиса-Ментен представляют в двойных обратных координатах, то есть, единицу делят на V₀ и переворачивают дробь в правой части уравнения:

(1)

Преобразовав уравнение (1), получаем один из часто применяемых способов линеаризации – уравнение Лайнуивера-Берка:

(2)

При построении зависимости в двойных обратных координатах, 1/V₀ от 1/[S]₀, как показано на рисунке 1, получаем прямую. Из уравнения линейной регрессии можно определить интересующие константы.

Рисунок 1 – Зависимость начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата в координатах уравнения Лайнуивера-Берка.

Отсекаемый отрезок на оси ординат дает обратную максимальную скорость, а на оси абсцисс – обратную константу Михаэлиса с противоположным знаком. Или же определяют непосредственно из уравнения прямой обратную максимальную скорость, а потом константу Михаэлиса из тангенса угла наклона прямой (рисунок 1).

Точность определения кинетических параметров таким способом считается невысокой. Чем меньше концентрация субстрата, тем выше оказывается ошибка определения обратной скорости.

Домножив обе части уравнения (2) на начальную концентрацию субстрата [S]₀, получаем уравнение Хейнса:

(3)

Построив зависимость [S]₀/V₀ от [S]₀, как показано на рисунке 2, получим прямую, из уравнения линейной регрессии которой можно определить параметры V_max и K_M.

Рисунок 2 – Зависимость начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата в координатах уравнения Хейнса.

Существует еще один вариант преобразования уравнения Михаэлиса-Ментен. Для его осуществления избавляются от знаменателя, умножив на него обе части исходного уравнения и делят обе части на :

(4)

Мы получили уравнение Иди-Хофсти. Его графиком является прямая в координатах V₀ от [S]₀/V₀, из уравнения линейной регрессии которой можно определить те же кинетические параметры — V_max и K_M в соответствии с рисунком 3.

Рисунок 3 – Зависимость начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата в координатах уравнения Иди-Хофсти.

Статистический анализ показывает, что методы Хейнса и Иди-Хофсти дают более точные результаты, чем метод Лайнуивера-Берка. Причиной этого является то, что в первых двух графиках и зависимые, и независимые переменные входят в величины, откладываемые на обеих осях координат.

Нередко наблюдается спрямление экспериментальных данных в координатах уравнения Лайнуивера-Берка и невозможность такого преобразования по остальным уравнениям. Это говорит о том, что результаты, полученные посредством одной линеаризации, не слишком надежды и необходимо применять все три одновременно.

Очень точный графический метод – «прямой график» Эйзенталя-Боудена. Каждой начальной концентрации субстрата [S]_i соответствует значение начальной скорости V_i (i = 1,2,…n). Значения [S]_i с обратным знаком откладываются на оси абсцисс, на оси ординат – значения V_i. Через полученные пары точек проводят прямые, пересекающие координатные оси в точках (-[S]_i, 0) и (0, V_i). Проекция общей точки пересечения прямых на горизонтальную ось равна К_М, а на вертикальную – V_max (рисунок 4).

Разброс экспериментальных данных в этом методе учитывают с помощью нахождения медианы (в случае непрерывных распределений медианой является место, выше и ниже которого находится по 50% экспериментальных значений; другими словами, значения, лежащие ниже и выше медианы, встречаются с вероятностью 0,5).

Рисунок 4 – Определение констант уравнения Михаэлиса-Ментен по методу Корниш-Боудена.

Для определения максимальной скорости и константы Михаэлиса применяют также метод Диксона, согласно которому точку начала координат соединяют прямыми линиями с точками на кривой уравнения Михаэлиса-Ментен, соответствующими значениям , , , … Прямые отсекают на горизонтальной линии одинаковые отрезки, длина которых равна К_М (рисунок 5). То есть, метод предполагает, что величина определена. Следует отметить, что отсекаемые отрезки одинаковы только в том случае, если определена верно (рассчитанное каким-то другим методом значение максимальной скорости близко к истинному). Если это не так, будут наблюдаться расхождения:

— если рассчитанная меньше истинного значения, то с увеличением начальной концентрации субстрата значения К_М монотонно убывают;

— если рассчитанная больше истинной, то с увеличением начальной концентрации субстрата определяемые значения монотонно возрастают.

То есть, метод позволяет установить точность определения .

Рисунок 5 – Определение КМ по методу Диксона.

Анализируя графическим методом, проведем касательную к кривой в координатах уравнения Михаэлиса-Ментен. Для этого необходимо продифференцировать уравнение и подставить в полученную функцию значение концентрации в той точке, касательная к которой необходима – это точка (0;0), так что . В результате получаем угловой коэффициент касательной. Зная его и одну точку прямой (точка (0;0)), строим касательную и продляем до горизонтальной линии . В том случае, если начальная концентрация субстрата очень велика по сравнению с концентрацией фермента ( ), расстояние между касательной (горизонтальная линия ) к кривой в координатах уравнения Михаэлиса-Ментен при и осью ординат также равно К_М. Если оно оказывается больше К_М, то концентрацией фермент-субстратного комплекса [ES] нельзя пренебречь и можно определить графически значения [ES], [E] и [S] в каждой точке этой кривой. Если провести прямую, параллельную оси абсцисс, отрезок между осью ординат и касательной будет численно равен концентрации фермент-субстратного комплекса, а отрезок между касательной и перпендикуляром на ось абсцисс из точки пересечения касательной с прямой — концентрации свободного фермента [E]. Длина отрезка между кривой Михаэлиса-Ментен и касательной дает значение концентрации субстрата в этой же точке (рисунок 6).

🎥 Видео