Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами уравнение (4 видео)

Осаждение белков при нагревании

№ пробирки	Реакция среды	Наблюдаемые изменения	Причина изменений
1.	Нейтральная
2.	Слабокислая
3.	Сильнокислая
4.	Сильнокислая + NaCl
5.	Щелочная

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ

Концентрированные минеральные кислоты (кроме ортофосфорной) вызывают необратимое осаждение белков. Это объясняют как явлениями дегидратации молекул белка, так и рядом других причин (денатурация, образование нерастворимых солей и др.). В избытке минеральных кислот, кроме азотной, выпавший остаток белка растворяется. Желатин не осаждается минеральными кислотами.

ХОД РАБОТЫ. В три пробирки вносят 1,5-2,0 мл следующих концентрированных кислот: в первую – соляной, во вторую – серной, в третью – азотной. Затем, наклонив пробирки под углом 45°, осторожно по стенке наслаивают 0,5-1,0 мл раствора белка (молоко или раствор яичного белка). На границе соприкосновения двух слоев образуется осадок в виде белого кольца. Пробирки осторожно встряхивают и наблюдают за состоянием осадка. Осадок, выпавший при действии азотной кислоты, увеличивается, а осадки, выпавшие при действии соляной и серной кислот, растворяются в их избытке. Результаты этой и всех последующих реакций вносят табл. 6.

Таблица 6 Осаждение белков

№ пробы	Название осадителя	Характер осадка	Растворимость осадка в избытке осадителя
Соляная кислота
Серная кислота
Азотная кислота
Сульфосалициловая кислота
Трихлоруксусная кислота
Сульфат меди
Ацетат свинца
Нитрат серебра
Этанол

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ОРГАНИЧЕСКИМИ КИСЛОТАМИ

Из органических кислот в качестве осадителей белков широко применяют трихлоруксусную кислоту (ТХУ) и сульфосалициловую кислоту.

Механизм осаждения белков этими кислотами объясняют денатурацией и дегидратацией молекулы белка. ТХУ осаждает только белки и не осаждает продукты их гидролиза. Это имеет важное значение для определения белкового и небелкового азота. Сульфосалициловая кислота осаждает белки и высокомолекулярные пептиды.

ХОД РАБОТЫ. В две пробирки наливают по 1 мл раствора белка яиц и добавляют равный объем в первую – раствора с массовой долей ТХУ 10 %, в другую – раствора с массовой долей сульфосалициловой кислоты 10 %. Выдерживают 5 мин и результат опыта вносят в табл. 6.

При осаждении белков конечная концентрация органических кислот в растворе должна быть не менее 2,5-5 %. При осаждении белков молока она должна составлять 12 %.

Видео:Осаждение белков минеральными кислотамиСкачать

Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами уравнение

Реакции осаждения белков

4. Реакции осаждения белков

Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора.

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.

Высаливание. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором — глобулиновая фракция.
Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка.

1) неразведенный яичный белок;

2) насыщенный раствор сульфата аммония;

3) NaOH, 10% раствор,

4) CuSO 4 , 1% раствор;

5) дистиллированная вода;

6) сульфат аммония в порошке.

Ход определения. В пробирку наливают 30 капель неразведенного яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор пока не прекратится растворение соли, при этом выпадает осадок — глобулины.

Необратимое осаждение белков.

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.

Осаждение при кипячении.

Белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-60 градусов С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую глобулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку частицы белка при этом наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами — в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором — отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) уксусная кислота, 1% и 10% растворы;

3) NaOH, 10% раствор.

Ход определения. В 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель раствора яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипячения, при этом раствор мутнеет, но т.к. частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (его изоэлектрическая точка 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно; во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипячения. Белок выпадает в осадок, т.к. его раствор приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в растворе); в 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, т.к. в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в растворе); в 4-ю пробирку наливают 1 каплю раствора NaOH, нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд белка увеличивается.

Осаждение концентрированными минеральными кислотами.

Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислоты выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная кислота.

1) яичный белок,1% раствор;

2) концентрированная серная кислота;

3) концентрированная хлористоводородная кислота;

4) концентрированная азотная кислота.

Ход определения. В три пробирки наливают по 5 капель концентрированной серной, хлористоводородной и азотной кислот. затем, наклонив пробирку под углом 45 градусов, осторожно по стенке наслаивают такой же объем яичного белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной кислотами, в пробирке с азотной кислотой растворения белка не происходит.

Осаждение органическими кислотами.

Трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой кислотой пользуются при определении белка в моче.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) трихлоруксусная кислота, 10% раствор;

3) сульфосалициловая кислота, 10% раствор.

Ход определения. В две пробирки вносят по 5 капель раствора белка. В одну из них прибавляют 2 капли сульфосалициловой кислоты, а в другую — 5 капель трихлоруксусной кислоты. В пробирках выпадает осадок белка.

Осаждение белка солями тяжелых металлов.

Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) сульфат меди, 10% раствор;

3) ацетат свинца, 5% раствор;

4) нитрат серебра, 5% раствор.

Ход определения. В три пробирки вносят по 5 капель белка. В первую добавляют 1 каплю ацетата свинца, в третью — 1 каплю нитрата серебра. Во всех пробирках выпадает осадок. Затем в первую пробирку добавляют 10 капель нитрата серебра — растворения осадка нет.

Видео:осаждение белков конц минеральными кислотамиСкачать

Лабораторная работа №3 Физико-химические свойства белков

Лабораторная работа №3

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Белки — высокомолекулярные соединения (их молекулярный вес колеблется от нескольких тысяч до десятков миллионов), большинство их обладает гидрофильными свойствами, т. е. они имеют большое сродство к воде.

Размер белковых молекул соответствует размерам коллоидных частиц (0,1 — 0,001 мкм), поэтому растворы белка обладают свойствами коллоидных растворов. В отраженном свете они опалесцируют, дают эффект Тиндаля (при боковом освещении виден светящийся конус), частицы белка не способны проникать через полупроницаемые мембраны.

Коллоидные растворы белка достаточно устойчивы. Такая стабильность белковых растворов обусловлена двумя основными факторами: во-первых, белковая частица несет электрический заряд, и, во-вторых, вокруг белковой молекулы образуется плотная водная оболочка, состоящая из нескольких слоев, что препятствует коагуляции (объединению) белковых молекул и выпадению их в осадок. Присутствие водной оболочки объясняется наличием на поверхности белковой молекулы большого количества гидрофильных полярных групп, связывающих частицы воды.

Наличие электрического заряда обусловлено способностью белковой молекулы диссоциировать в водных растворах и давать ионы. Белки, как и их структурные элементы — аминокислоты, благодаря одновременному присутствию СООН-групп (кислотных) и NН2-групп (основных) являются амфолитами (амфотерными электролитами):

В кислой среде они проявляют основные свойства и несут положительный заряд (катионы):

В щелочной среде они проявляют кислотные свойства, несут отрицательный заряд (анионы):

Поскольку белки имеют различный аминокислотный состав, то в зависимости от преобладания в молекуле белка дикарбоновых аминокислот (глутаминовой, аспарагиновой) или диаминомонокарбоновых аминокислот (лизина, аргинина) белки в водных растворах обладают, соответственно, свойствами слабых кислот или слабых оснований. Большинство природных белков имеют кислый характер (альбумины, глобулины) и в водном растворе несут отрицательный заряд; основные белки (протамины, гистоны) в водном растворе несут положительный заряд.

Схематически это можно представить следующим образом:

При добавлении кислоты к водному раствору белка его кислотная диссоциация понижается, согласно закону действия масс, основная же диссоциация соответственно повышается, наступает момент, когда кислотная диссоциация делается равной основной; общий заряд белковой молекулы при этом становится наименьшим, так как в этом случае белковая частица несет на себе равное количество положительных и отрицательных зарядов, уравновешивающих друг друга. При дальнейшем добавлении кислоты кислотная диссоциация белка еще больше подавляется, и белок приобретает положительный заряд (катион); таким образом, происходит перезарядка коллоидных частиц. Наоборот, при действии щелочей понижается основная и усиливается кислотная диссоциация, и белок заряжается отрицательно. Такое значение рН, при котором частицы белка несут равное количество положительных и отрицательных зарядов (белок находится в изоэлектрическом состоянии), называется изоэлектрической точкой. В изоэлектрической точке белок легко выпадает в осадок. Это можно объяснить тем, что в изоэлектрическом состоянии белок лишается одного из стабилизирующих факторов и вследствие снятия заряда прекращается взаимоотталкивание частиц; под влиянием межмолекулярных сил притяжения такие частицы образуют более крупные агрегаты и выпадают в осадок.

Осаждение белка из раствора может быть достигнуто многими разнообразными приемами. Реакциями осаждения пользуются для обнаружения белка в растворе, для разделения белковых фракций, а также для получения безбелковых фильтратов.

Оборудование, реактивы. Фильтры бумажные; растворы белков; воронка стеклянная; пробирки стеклянные химические; сульфат аммония (кристалл. и насыщ.); пипетки глазные, уксусная кислота 1 и 10% растворы, натрия хлорид насыщенный раствор; едкий натр 10% раствор, спирт этиловый или ацетон; серная кислота, соляная кислота, азотная кислота и уксусная кислота концентрированные, сульфосалициловая кислота 10% (20%) раствор, трихлоруксусная кислота 10% раствор (5%), пикриновая кислота 10% раствор, танин 10% раствор (насыщенный раствор), калий железистосинеродистый 5% раствор, меди сульфат 7% (5%) раствор, свинец уксуснокислый (ацетат свинца) 5% раствор, серебра нитрат 5% раствор, соляная кислота 5% раствор, формалин.

Реакции осаждения белков

Для осаждения белка нужно лишить его факторов, удерживающих его в растворе, используя различные агенты, снижающие заряд или разрушающие гидратную оболочку белковой частицы.

Белки под влиянием изменения рН, повышения температуры, излучения различных длин волн, радиоактивного излучения, а также ряда химических веществ (органические растворители, тяжелые металлы и др.) претерпевают глубокие изменения в пространственной нативной структуре молекулы, в результате которых теряется способность белка растворяться в обычных для них растворителях (вода, солевые растворы и др.). Белки при этом теряют свои гидрофильные свойства и приобретают гидрофобные. Пептидные связи в белках при денатурации не гидролизуются.

Фактически процесс денатурации белка сводится к разрушению нативной вторичной и третичной структуры белка, при этом белковая молекула, как правило, теряет свои биологические свойства.

Реакции осаждения белков весьма разнообразны, однако их можно разделить на две группы:

1) практически необратимые реакции осаждения, при которых белки претерпевают глубокие изменения н не могут быть вновь растворены в первоначальном растворителе. В этом случае наступает денатурация белка. К необратимым реакциям относятся осаждение белка солями тяжелых металлов, алкалоидными реактивами, минеральными и органическими кислотами и осаждение при нагревании;

2) обратимые реакции осаждения, при которых осаждаемые белки не подвергаются глубоким изменениям и поэтому получаемые осадки белков могут быть растворены в первоначальном растворителе. Молекула белка при этом сохраняет свои первоначальные нативные, включая биологические, свойства и не подвергается заметной денатурации.

К обратимым реакциям осаждения следует отнести осаждение белков органическими растворителями (спиртом или ацетоном) и высаливание белков (осаждение под влиянием концентрированных растворов нейтральных солей: NН4С1, NаСl, (NН4)2SО4 и др.)/

Работа 1. Осаждение белка при нагревании

Почти все белки денатурируют при нагревании (50 — 55°С и выше). Механизм тепловой денатурации связан с перестройкой структуры белковой молекулы, в результате которой белок теряет свои нативные свойства, уменьшается его растворимость (уменьшение гидрофильных свойств ведет к нарушению гидратной оболочки). Присутствие солей и концентрация водородных ионов играют важную роль в выпадении в осадок денатурированного при нагревании белка. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке белка, т. е. при такой величина рН, когда коллоидные частицы белка являются наименее устойчивыми. Поэтому для полного осаждения белка при нагревании следует создавать реакцию среды, соответствующую его изоэлектрической точке.

Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждают в слабокислой среде, белки, обладающие щелочными свойствами, — в слабощелочной среде.

В сильно кислых (за исключением азотной, трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот) и сильно щелочных растворах денатурированный при нагревании белок не выпадает в осадок, так как частицы белка перезаряжаются (или происходит усиление имеющегося заряда) и несут в первом случае положительный, во втором случае отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе в результате электростатических сил отталкивания. Поэтому в сильно кислых и сильно щелочных растворах белки обычно не выпадают в осадок при нагревании. Однако в сильно кислых растворах белки при нагревании могут коагулировать при добавлении достаточного количества какой-либо нейтральной соли. Степень влияния ионов нейтральных солей на осаждаемость белка зависит от их способности адсорбироваться па частицах белка. Адсорбированные ионы соли (если они противоположны по знаку заряду коллоидной частицы) нейтрализуют заряд частицы; наступает момент, когда силы притяжения между молекулами превышают силы отталкивания, и белок выпадает в осадок.

В отличие от осаждения солями свертывание белков при нагревании – денатурация белков — необратимо.

Ход работы. В пронумерованные пробирки наливают по 10 капель приготовленных растворов белка (для каждого вида белка готовят 5 пробирок).

Содержимое первых пробирок нагревают на газовой горелке.

Во вторые пробирки добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают.

В пробирки № 3 добавляют 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и содержимое нагревают.

В пробирки № 4 добавляют 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия.

В пробирки № 5 добавляют 1 каплю 10% раствора едкого натра и нагревают.